Микроорганизмам принадлежит исключительно важная роль в круговороте веществ в природе. Будучи широко распространеными в природе и обладая высокой ферментативной активностью, микроорганизмы осуществляют процессы расщепления и синтеза самых сложных органических веществ. Органические вещества (белки, жиры, углеводы) растений и животных под действием микроорганизмов расщепляются на более простые минеральные элементы, растворяются в воде и вновь используются растениями в качестве источника питания. Круговорот веществ в природе можно представить в виде длинной цепи последовательно и тесно связанных между собой реакций. Некоторые биохимические процессы, протекающие в микроорганизмах, сопровождаются накоплением в питательной среде ценных веществ, поэтому микроорганизмы используются при получении белков, ферментов, витаминов, органических кислот, спиртов и других продуктов! Развиваясь в рыбном сырье, в продуктах его переработки и вспомогательных материалах, микроорганизмы могут накапливать вещества, которые либо улучшают их вкус и аромат, либо приводят к порче.
Изучение биохимических процессов, вызываемых микроорганизмами, раскрывает сущность тех изменений, которые происходят в пищевом сырье и продуктах его переработки при развитии в них микроорганизмов и позволяет правильно организовать технологический процесс.
По субстрату, на который действуют микроорганизмы, все превращения, происходящие под действием микроорганизмов, можно разделить на три вида: превращения органических веществ, не содержащих азота (различные виды окисления и брожения); превращения органических веществ, содержащих азот (гниение); превращения минеральных азотсодержащих веществ.
Превращение бехазотистых органических углеродсодержащих веществ.
Круговорот углерода начинается с накопления С02 атмосферы зелеными растениями и автогрофными микроорганизмами. Часть накопленного растениями углерода потребляется человеком и животными, которые затем выделяют его в форме С02 в процессе дыхания.
Ведущая роль в возвращении углерода в атмосферу принадлежит микроорганизмам. В процессах окисления и брожения они расщепляют самые разнообразные органические соединения. Более доступными являются углеродсодержащие соединения, растворимые в воде (углеводы, спирты). Но в естественных условиях (в почве, воде, в тканях растений и животных) в большем количестве встречаются труднорастворимые соединения углерода, такие, как жиры, целлюлоза, пектиновые вещества. В них сосредоточена основная масса углерода. Разложение их начинается с гидролиза, в результате чего образуются более простые соединения. Дальнейшие превращения данных соединений осуществляются в реакциях окисления или брожения.
Аэробные процессы. Жиры (липиды) часто встречаются в животных и растительных клетках в виде запасных питательных веществ. По химическому составу они представляют собой сложные эфиры глицерина и остатков либо одной, либо нескольких различных жирных кислот. Жиры рыб, морских животных и растительных масел характеризуются большой ненасыщенностью жирных кислот и поэтому подвержены быстрому окислению. Большинство бактерий легко осуществляет гидролиз липидов до глицерина и жирных кислот и в то же время с трудом разрушает высшие жирные кислоты. В дальнейшем окисление глицерина и жирных кислот идет разными путями.
Глицерин фосфорилируется, затем окисляется через фосфоглицериновую кислоту до фосфоглицеринового альдегида; последний гликолитическим путем — в пировиноградную кислоту, которая в зависимости от виде вой специфичности микроорганизма подвергается дальнейшим превращениям. Окисление образовавшихся при гидролизе свободных жирных кислот происходит также довольно сложным путем. Дальнейшее превращение кислоты состоит из ряда окислений с участием ферментов липооксигеназ. Окисление жирных кислот заключается в последовательном отделении двух атомов углерода, дающих уксусную кислоту, и образовании новой жирной кислоты подвергающейся снова окислению до оксикислот, затем до кетокислот и путем декарбоксилирования до алкилметилкетонов. Получающаяся в результате окисления уксусная кислота подвергается дальнейшим превращениям через ряд промежуточных реакций цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса) до СO2 и Н2O. Кроме названных соединений в окисленных жирах встречаются альдегиды, моно- и диглицериды, вторичные спирты, лактоны.
Выраженной липолитической и липооксигеназной активностью обладают некоторые виды Pseudomonas fluorescens, Achromobacter lipoliticum, Bact. stearothermophylus, Staphylococcus aureus, липазы которого особенно активны в период интенсивного роста, бактерии рода Micrococcus, микроскопические грибы, дрожжи,
К роду Pseudomonas отнесены подвижные грамотрицательные неспороносные палочки с полярно расположенными одним или несколькими жгутиками (моно- и лофотрихи). Многие виды образуют желто-зеленые и сине-зеленые флюоресцирующие пигменты, проникающие в среду и окрашивающие ее в соответствующий цвет. Эти виды хорошо растут на обычных питательных средах, обладают большим разнообразием ферментов: кроме жиров они способны расщеплять белки, сбраживать углеводы (глюкозу), расщеплять крахмал, клетчатку.
Бактерии рода Achromobacter очень сходны с бактериями рода Pseudomonas. Эти мелкие грамотрицательные неспороносные подвижные палочки являются перитрихами. Как Pseudomonas, так и Achromobacter являются аэробами (в анаэробных условиях рост их замедляется или прекращается совсем) и психрофилами. Их кардинальные температурные точки следующие: минимум 0 — 5°С, оптимум 10 — 20°С, максимум 26 — 35 С. Все эти микроорганизмы широко распространены в природе — воздухе, воде, почве, встречаются на рыбе и рыбопродуктах, являются главной причиной прогоркания жира в результате накопления продуктов окисления - метил- кетонов, альдегидов с небольшим молекулярным весом, а также свободных жирных кислот с короткой углеродной цепью (с 4 — 12 атомами углерода). Окисление жиров не только ведет к большому материальному ущербу из-за порчи технических и пищевых рыбопродуктов, но и связано с токсическим действием продуктов окисления на организм человека.
К уксуснокислому окислению относится окисление этилового спирта до уксусной кислоты уксуснокислыми бактериями и углеводов микроскопическими грибами:
СН3СН2ОН + 02-----------------------> СН3СООН + Н20 + х кДж.
Этиловыйспирт Уксуснаякислота
Уксуснокислые бактерии способны окислять не только этиловый спирт в уксусную кислоту, но и бутиловый — в масляную кислоту, пропиловый — в пропионовую. Возбудителями являются облигатные аэробы, грамотрицательные, не образующие спор, подвижные палочки с перитрмхиально (родов Acetobacter) и полярно (рода Acetomonas) расположенными жгутиками. Эти микроорганизмы растут на поверхности питательных сред. Широко распространены в природе: в воздухе, почве, воде, на поверхности плодов и ягод. Уксуснокислые бактерии используются для приготовления пищевого уксуса, производства глюконовой кислоты, витамина С. Уксуснокислое окисление наблюдается в слабокислых пастеризованных маринадах при хранении их в негерметичной таре.
Некоторые микроскопические грибы при развитии в органических субстратах способны продуцировать различные органические кислоты: щавелевую, лимонную, фумаровую, янтарную, которые способствуют растворению минеральных солей в почве, переводят их в легко усвояемые растениями химические соединения, способствуя тем самым повышению плодородия почвы. Этот вид окисления называется лимоннокислым окислением. Химический и производственный процессы получения лимонной кислоты изучены и разработаны С. П. Костычевым и В. С. Буткевичем. При окислении Сахаров грибами родов Penicillium и Aspergillus образуется лимонная кислота:
2С6Н 1206 + 302----------------> 2С6Н807 + 4Н20 + х кДж.
Глюкоза Лимонная кислота
Лимонная кислота используется в кондитерской, консервной промышленности, в производстве безалкогольных напитков, в качестве консервата.
Щавелевокислое окисление вызывается также грибами Penicillium и Aspergillus:
2С6Н1206+ 902-----------------------> 6 (СООН)2 + 6Н20 + х кДж.
Глюкоза Щавелевая кислота
Фумаровокислое окисление вызывается грибами Mucor, Rhizopus:
C6H12О6 +3О2--------------> С4Н4О4 + 2С02 + 4Н20 - х кДж.
Глюкоза Фумаровая кислота
Целлюлоза - высокомолекулярное соединение является одним из компонентов растительных клеток, входит в состав клеточных стенок и определяет их механическую прочность. При участии микроорганизмов происходит разложение целлюлозы с образованием целлобиозы и глюкозы:
(С6Н10О5) + Н2О---------------> С12Н22О11+ Н2О + С6Н12О6.
Целлюлоза целлобиоза Глюкоза
В аэробных условиях продукты гидролиза целлюлозы подвергаются окислению до С02 и Н20. Вызывают этот процесс грибы родов Fusarium, Trichoderma, Aspergillus и другие, а также бактерии родов Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium вибрионы рода Cellvibrio и актиномицеты.
Пектиновые вещества в виде нерастворимого в воде протопектина склеивают между собой клетки в тканях растений, образуя межклеточные пластинки, а также входят в состав клеточных оболочек. Разложение пектиновых веществ происходит при участии пектолитических ферментов микроорганизмов:
С46Н68О40+ 10Н2О------------------->4СНО (СНОН)4СООН + C6H1206 +
Пектиновая кислота Галактуроновая кислота Галактоза
+ С5Н10О5 + С5Н10О5 + 2СН3ОН + 2СН3СООН.
Ксилоза Арабиноза Метиловый сп. Уксусная кислота
В аэробных условиях продукты ферментативного гидролиза пектиновых веществ - ксилоза, арабиноза, галактоза окисляются до С02 и Н20 грибами родов Mucor, Cladosporium, Alternaria и бактериями Вас. subtilis.
Анаэробные процессы. К числу важнейших биохимических процессов, вызываемых микроорганизмами, относятся различные виды брожения. Брожение — это анаэробный процесс окисления углеводов. При накоплении в питательной среде спирта брожение носит название спиртового, масляной кислоты — маслянокислого, молочной — молочнокислого, пропионовой — пропионовокислого и т. д.
Основными типами брожения могут считаться три: спиртовое, молочнокислое, маслянокислое. Остальные типы брожения являются как бы их комбинацией. Основные типы брожения до пировиноградной кислоты идут с образованием одних и тех же промежуточных продуктов и по одному и тому же гликолитическому пути. Образующийся в этом процессе НАД ° Н в анаэробных условиях не может быть окислен кислородом. Для восстановления НАД бактерии используют пировиноградную кислоту. В результате в среду выделяются различные восстановленные продукты — спирты или.кислоты.
Возбудителями спиртового брожения в основном являются дрожжи рода Saccharomyces, а также мукоровые грибы и некоторые бактерии. При производстве спирта используются дрожжи верхового брожения. Верховое брожение идет при температуре 20 — 28°С и сопровождается обильным выделением углекислоты с образованием пены. Дрожжевые клетки выносятся на поверхность сбраживаемого субстрата.
Наиболее энергично процесс спиртового брожения идет в кислой среде при рН 4,0 — 4,5, оптимальной температуре 30°С и концентрации сахара 10 — 15%. Повышение концентрации сахара приводит к замедлению, а затем прекращению брожения. Суммарно спиртовое брожение можно выразить уравнением
С6Н12О6---------------------> 2С2Н5ОН + С02 + 118 кДж.
Глюкоза Этиловый спирт
В щелочной среде вместо спирта образуется глицерин и уксусный альдегид — это так называемая глицериновая форма брожения
С6Н12Об------------------> С3Н5 (ОН) 3 + СН3СОН + С02.
Глюкоза Глицерин Уксусный альдегид
Глицерин применяется в различных отраслях промышленности.
Спиртовое брожение используется для производства спирта, вин, пива, хлеба. Но спиртовое брожение может быть причиной и порчи пищевых продуктов. При неправильном хранении дрожжи вызывают вспучивание томатной пасты, ухудшение качества растительного сырья и заливок за счет появления запаха спирта.
Молочнокислое брожение представляет собой анаэробное превращение углеводов с образованием молочной кислоты. Молочнокислое брожение может быть представлено суммарно уравнением
С6Н12Об------------------> 2СН3СНОНСООН +х кДж.
Глюкоза Молочная кислота
Возбудителями молочнокислого брожения являются молочнокислые бактерии родов Lactobacterium и Streptococcus. Это бессиоровые грамположительные неподвижные палочки и кокки, микроаэрофилы, не имеющие цитохромов и цитохромоксидазы для использования кислорода воздуха. Брожение является для них единственным источником энергии. Очень требовательны к питательным средам.
В зависимости от конечных продуктов брожения молочнокислые бактерии делятся на две группы: гомоферментативные (однотипно-бродящие) и гетероферментативные (разнотипно-бродящие). Гомоферментативные молочнокислые бактерии при участии фермента лактатдегидрогеназы восстанавливают пировиноградную кислоту в молочную.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии благодаря разнообразию имеющихся у них ферментов из сахара образуют кроме молочной кислоты и другие продукты брожения по следующему уравнению:
С6Н12Об-----> СН3СНОНСООН + СООНСН2СН2СООН + СНзСООН + СН3СН2()Н + С02 +Н2+х кДж.
Глюкоза Молочная кислота Янтарная кислота Уксуснаякислота Этиловый спирт
Некоторые молочнокислые бактерии продуцируют ароматобразующие вещества — ацетоин, диацетил.
Молочнокислое брожение лежит в основе производства пресервов и созревания рыбы при посоле. Молочнокислые бактерии, особенно ароматобразующие, придают специфические вкус и запах этим продуктам, однако если среди них есть газообразующие, то при благоприятных температурных условиях они вызывают бомбаж пресервов. Молочнокислые бактерии могут вызвать брожение растительного сырья, используемого в консервном производстве, в частности томатопродуктов.
Окисление углеводов при маслянокислом брожении происходит с образованием масляной кислоты, углекислого газа и водорода:
С6Н1206---------------------> СН3СН2СН2СООН + 2С02 + 2Н2 + х кДж.
Глюкоза Масляная кислота
При маслянокислом брожении все превращения происходят в той же последовательности, что и при спиртовом, вплоть до образования уксусного альдегида. Однако восстановления образовавшегося уксусного альдегида до спирта не происходит, так как в ферментативном комплексе маслянокислых бактерий отсутствует алькогольдегидрогеназа. Вместо восстановления уксусного альдегида происходит его альдольное уплотнение с последующей трансформацией альдоля в масляную кислоту. Альдольное уплотнение катализируется ферментом карболигазой:
СНзСОН (Карболигаза) СН3СН0Н - СН2СОН--------------------->СН3СН2СН2СООН
Уксусный альдегид Ацетапвдоль Масляная кислота
Маслянокислое брожение более активно протекает при 35°С. Возбудители брожения - маслянокислые бактерии рода Clostridium. Это подвижные крупные палочки, перитрихи, строгие анаэробы; оптимум рН 6,9 - 7,4; при рН 4,5 — 4,9 и ниже прекращают развитие. Они образуют споры, располаг ающиеся центрально или ближе к концу палочки. Устойчивы к действию различных факторов, выдерживают кипячение в течение нескольких минут. Характерной особенностью бактерий является наличие в клетках крахмалоподобного вещества - гранулезы. К маслянокислым бактериям относятся CI. pasteurianum, CI. amylobacter, CI. butyricum, CI. saccharobutyricum. Маслянокислое брожение — чрезвычайно распространенный в природных условиях процесс анаэробного разложения органических веществ, поэтому возбудителей этого брожения можно обнаружить всюду, где есть растительные остатки: в почве, в иле водоемов и других естественных субстратах, лишенных доступа кислорода, а также в кишечнике человека и животных. Сохранившиеся после термической обработки споры маслянокислых бактерий, развиваясь в вегетативные клетки, вызывают бомбаж консервов и придают им неприятный прогорклый вкус масляной кислоты, в результате чего продукт становится непригодным к употреблению.
В анаэробных условиях происходит брожение целлюлозы с образованием масляной и уксусной кислот, углекислого газа, этилового спирта и водорода. Сущность этого процесса впервые была раскрыта В. Л. Омелянским.
Им были выделены целлюлозоразрушающие бактерии, которые были названы его именем. Бактерии Омелянского имеют форму длинных и тонких палочек и относятся к роду Clostridium; оптимальная температура развития 30 — 35°С. Брожение целлюлозы вызывают и некоторые термофильные бактерии в частности CI. thermocellum, оптимальная температура роста которых 60 С. Термофильные целлюлозоразрушающие микроорганизмы были подробно изучены А. А. Имшенецким. Целлюлозоразрушающие микроорганизмы широко распространены в природе: почве, воздухе, речном иле, сточных водах.
Брожение целлюлозы с обильным выделением газов встречается в болотах, прудах, закрытых водоемах (болотный газ). Происходящие в природе процессы брожения целлюлозы играют большую роль в образовании перегноя — гумуса почвы и водоемов. Биохимические процессы, происходящие под действием целлюлозоразрушающих микроорганизмов, имеют большое значение в круговороте углерода в природе.
В анаэробных условиях продукты гидролиза пектиновых веществ — ксилоза, галактоза, арабиноза сбраживаются по типу маслянокислого брожения с образованием уксусной и масляной кислот, углекислого газа и водорода. Пектиновое брожениев анаэробных условиях вызывают бактерии Clostridiumpectinovorum и Clostridiumfelsineum. Под влиянием ферментов этих микроорганизмов происходит размягчение и даже мацерация (распад) растительных тканей.