В цикл превращений азота, вызываемых различными микроорганизмами, входят реакции синтеза сложных азотистых соединений (белков) и реакции минерализации их до солей азотной и азотистой кислоты или молекулярного азота. Этот цикл состоит из четырех этапов.
Первый этап— фиксация молекулярного азота, конечным продуктом которого являются азотсодержащие органические вещества.
Второй этап — минерализация азотсодержащих веществ, или гнилостные процессы. Конечным продуктом данных процессов является аммиак.
Третий этап — окисление аммиака до нитратов и нитритов, или нитрификация.
Четвертый этап — частичное усвоение нитратов корневой системой растений и частичное восстановление их до аммиака и молекулярного азота, или денитрификация.
Фиксация молекулярного азота. Изучение природы биологической фиксации азота было начато С. Н. Виноградским в 1893 г. и продолжено В. Л. Омелянским, СЛ. Костычевым, М. В. Федоровым и др. Способностью фиксировать молекулярный азот обладают многие микроорганизмы, принадлежащие к различным систематическим группам: бактерии, актиномицеты, грибы, цианобактерии.
Азотфиксирующие микроорганизмы можно разделить на две группы: свободноживущие и симбиотические, т. е. вступающие в сожительство с высшими растениями. Классическими представителями свободноживущих азотфиксаторов являются бактерии рода Azotobacter и анаэробная палочка CI. pasteurianum.
Бактерии рода Azotobacter в молодой культуре - крупные палочки, с возрастом они постепенно уменьшаются в размерах и превращаются в кокки, покрытые толстой слизистой капсулой. Молодые клетки подвижны, перитрихи. При старении и образовании капсул подвижность утрачивается. В зависимости от вида образуются на плотных питательных средах полупрозрачные выпуклые колонии, окрашенные в желтый (Az. vinelandii), темно- коричневый (Az. chroococcum) или флюоресцирующий желто-зеленый цвет (Az. agile). Оптимальная температура развития 28 — 30 С, рН 7,2 - 8,0, аэробы.
Бактерии рода Azotobacter обладают способностью синтезировать биологически активные вещества — витамины группы В, никотиновую и пантотеновую кислоты и фунгистатический (задерживающий рост грибов) антибиотик группы анисомицииа. Они широко распространены в почвах, водоемах, имеющих нейтральную или слабощелочную реакцию среды и содержащих легкодоступные органические вещества. Значительно улучшают рост растений и состояние кормовой базы водоема.
CI. pasteurianum - грамположительные облигатные анаэробы, предельное рН 5,5 — 8,0. Споры выдерживают температуру 96°С, а при 100°С погибают. Широко распространены во всех почвах, особенно в слежавшихся или залитых водой.
Связывать молекулярный азот воздуха могут и другие микроорганизмы: Azotomonasfluorescens, Azotomonasinsolita, микобактерии, фотосинтезирирующие бактерии, а также некоторые актиномицеты и циано- бактерии.
Наряду со свободноживущими азотфиксирующими микроорганизмами в почве обитают и симбиотические азотфиксаторы, открытые русским ученым М. С. Ворониным в 1866 г. на корнях люпина и ольхи в виде клубеньков, поэтому их стали называть клубеньковыми бактериями. Клубеньковые бактерии — грамотрицательные, не образующие спор подвижные палочки. В клубеньках клетки имеют раздутую или ветвистую форму, напоминающую буквы V, L, X. Такие формы принято называть бактероидами. Они проникают в корни растений через корневые волоски, где образуют инфекционные нити.
Способность азотфиксирующих бактерий фиксировать азот воздуха и обогащать им почву нашла практическое применение в изготовлении бактериальных удобрений - нитрагина и азотобактерина.
Гнилостные процессы. Процесс минерализации белковых веществ микроорганизмами, протекающий с выделением аммиака или образованием аммонийных солей, получил название гниения, или аммонификации белков. Расщепление белка начинается с процесса гидролиза, который осуществляется внеклеточными протеолитическими ферментами, выделяющимися гнилостными микроорганизмами. В результате образуются более простые продукты:
Белок + nН20--- > Пептоны + nН20---> Полипептиды +nН20---> Аминокислоты.
Из этих органических соединений наиболее доступны для микроорганизмов аминокислоты. Часть из них микроорганизмы используют для питания и получения энергии. Сами по себе аминокислоты не являются макроэргическими соединениями, но окисление некоторых из них сопровождается синтезом АТФ или образованием пировиноградной кислоты, входящей в цикл трикарбоновых кислот. Определенные микроорганизмы обладают специальными механизмами для получения энергии за счет окисления аминокислот. Конечный продукт гидролиза белка - аминокислоты диффундируют внутрь клеток микроорганизмов. Внутри клетки происходит расщепление аминокислот под действием эндоферментов — дезаминаз и декарбоксилаз. В результате этого может отщепляться или аминная NH2 (процесс дезаминирования), или карбоксильная С02 (процесс декарбоксилирования) группы.
При свободном доступе кислорода происходит глубокое расщепление белков, продукты гидролиза подвергаются полному окислению и образуют аммиак, углекислый газ, воду, сероводород, соли фосфорной кислоты.
Гниение белков в анаэробных условиях не сопровождается полным окислением промежуточных продуктов расщепления аминокислот. При дезаминировании аминокислот жирного ряда конечными продуктами могут быть аммиак и жирные кислоты (муравьиная, уксусная, масляная и др.), спирты, метан.
Аминокислоты, содержащие серу, расщепляются с выделением сероводорода, меркаптанов, обладающих неприятным запахом. При расщеплении аминокислот ароматического ряда промежуточными продуктами являются фенол, индол, скатол — вещества, тоже обладающие неприятным запахом. При декарбоксилировании диаминокислот с отщеплением углекислого газа из карбоксильной группы, но без отщепления аммиака образуются диамины (лизин, орнитин). Лизин превращается в кадаверин, орнитин — в путресцин. Органические соединения типа кадаверина и путрес- цина относятся к птомаинам, которые считались трупными ядами. В настоящее время установлено, что ядами являются не сами птомаины, а их производные (нейрин, мускарин, сепсин, гадинин и др.) .
В гниении принимают участие микроорганизмы, широко распространенные в воде, воздухе, почве. В настоящее время установлено, что в развитии процесса гниения наблюдается определенная закономерность и идет он в строгой последовательности: на разлагающейся массе первоначально доминируют бактерии, которые сменяются бациллами; в период максимального выделения аммиака к бациллам примыкают актиномицеты и микроскопические грибы.
Основными возбудителями гниения являются: аэробные, факультативно-анаэробные и анаэробные микроорганизмы.
К аэробным микроорганизмам, вызывающим гниение, принадлежат Baccillussubtilis, Bacillusmycoides, Bacilluscereus, Bacillusmegaterium, бактерии рода Pseudomonas.
Bacillussubtilis — очень подвижная, с перитрихиальным жгутикова- нием, грамположительная, спорообразующая аэробная палочка. Споры овальные, располагаются без строгой локализации (но чаще ближе к центру клетки). Обладает высокой протеолитической способностью, выделяет большое количество аммиака. Оптимальный рН 7,5 — 8,5. Развивается в широком диапазоне температур (от 5 до 60 С), оптимальная температура развития 35 — 40°С. Споры Вас. subtilis термоустойчивы и нередко сохраняются в консервах, стерилизованных при 120 С.
Bacillus mvcoides — подвижная грамположительная спорообразующая аэробная палочка, активный аммонификатор, при расщеплении белка, сероводорода не образует. На плотных питательных средах образует пушистые, стелющиеся по поверхности колонии, как грибной мицелий.
Бактерии рода Pseudomonas - аэробные подвижные палочки с полярным жгутикованием, неспорообразующие, грамотрицательные, многие виды холодоустойчивы, активно способствующие расщеплению белка. При рН ниже 5,5 и 5 — 6%-ном содержании соли в среде их биологическая активность снижается. Среди них есть антагонисты некоторых бактерий и грибов. Обитают в воде, почве, часто встречаются на рыбе.
К факультативно-анаэробным гнилостным микроорганизмам принадлежит Bact. Proteusvulgaris, который отличается большой полиморфностью: молодые культуры представляют собой мелкие палочки, при дальнейшем культивировании — длины нити. Обладает большой подвижностью (перитрихи), грамотрицательные. Колонии на агаре стелются по поверхности прозрачным налетом, так называемым роением. Отдельные клетки скользят по поверхности среды, дают начало росту новых клеток. Хорошо развиваются на белковых средах. При расщеплении белков выделяют амминый рН 6,5. Обнаруживаются в воде, почве, гниющих субстратах.
К анаэробным гнилостным микроорганизмам относятся CI. putrificum и CI. sporogenes. CI. putrificum - подвижная палочка (перитрих), споры шаровидные, расположены на конце в форме барабанной палочки, термоустойчивы. Белки расщепляют с образованием большого количества аммиака и сероводорода. Оптимальная температура развития 37 — 43°С, минимальная 5°С. Обнаруживаются в почве, воде, гниющих субстратах.
CI. sporogenes — подвижная палочка с перитрихиальным жгутикованием, споры овальные, расположены центрально, образуются быстро. Оптимальная температура 30 — 40°С, могут расти и при 50°С; минимальная — около 5 С. При расщеплении белков наблюдается обильное выделение сероводорода. Оба названных вида известны как возбудители порчи баночных консервов — бомбажа.
В гнилостном расщеплении белков принимают участие и различные ак- тинсмицеты и микроскопические грибы родов Penicillium, Mucor, Botritis, Aspergillus, Trichoderma и др.
В рыбообрабатывающей промышленности гниение является нежелательным процессом и наносит большой материальный ущерб. Порча рыбы, рыбопродуктов, консервов (если хранить их в условиях, благоприятных для развития гнилостных микроорганизмов) наступает быстро и протекает очень энергично. Лишь в отдельных случаях, например при созревании сельди, расщепление белков является необходимым процессом.
Разложение, или аммонификация, мочевины. Мочевина является конечным продуктом белкового обмена у большинства позвоночных животных и человека и выводится из организма с мочой. Количество мочевины, выделямой во внешнюю среду, очень велико.
Микробиологическую природу разложения мочевины впервые установил Луи Пастер. В настоящее время известна значительная группа уробактерий, вызывающих этот процесс. Многие из них вызывают гидролитическое разложение мочевины при участии фермента уреазы:
(NH2)2СО + 2H2О ----------> (NH4)2СО3.
Мочевина Углекислый аммоний
Аминная форма азота превращается в более легко усваиваемую аммиачную:
(NH4)2 С03------------> 2NH3 + С02 + Н20.
Разложение мочевины происходит преимущественно в аэробных условиях под действием таких микроорганизмов, как Micrococcusureae, Sarcinaureae, неспороносные палочки Urobacillpasteurii и спороносные палочки Urobacillusmiquelii и др. Перечисленные микроорганизмы довольно активны в слабокислой, нейтральной и щелочной среде (рН до 10). За счет разложения мочевины почва и водоемы обогащаются доступными для растений формами азота.
Нитрификация. Аммонийные соли, образующиеся в процессах аммонификации, подвергаются в почве окислению и переходят в соли азотистой и затем азотной кислоты. Процесс окисления аммиака и аммиачных солей до азотной кислоты называется нитрификацией, а бактерии, вызывающие его — нитрифицирующими. Сущность нитрификации была выяснена русским ученым С.Н. Виноградским в 1988 г. Нитрификация протекает в две фазы. В первой фазе аммиак окисляется до нитритов:
2NH3 + 302 --------- >-2HN02 + 2Н20 + х кДж.
Возбудителями первой фазы являются нитрозные бактерии родов Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosolobus.
Для второй фазы характерно окисление нитритов до нитратов:
2HN02 + 02 ---------- ?2HN03 +х кДж.
Возбудителями второй фазы нитрификации являются нитратные бактерии родов Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina.
Нитрифицирующие бактерии являются типичными хемоавтотрофами, которые развиваются на чисто минеральных средах, а для синтеза органических соединений используют углерод из С02. Нитрифицирующие бактерии являются аэробами, оптимальная температура развития 28 — 30°С, грамотрицательны, спор не образуют, энергию получают при окислении неорганических веществ. Нитрифицирующие бактерии широко распространены в природе: в почве, воде. Они обогащают почву и водоемы нитратами, которые являются основными источниками азотистого питания для растений.
Денитрификации. Денитрификацией называется процесс восстановления бактериями солей азотной кислоты до молекулярного азота:
KNO3 --------> KN02 -----------> KNO -------->N2.
Микроорганизмы, вызывающие денитрификацию, называются денитрифицирующими. Это в основном палочковидные бактерии Pseudomonasdenitrificans, Bact. stutzeri, факультативные анаэробы. Восстановление нитратов происходит в анаэробных условиях. Денитрифицирующие бактерии широко распространены в природе, встречаются в почве, воде. Денитрифицирующие микроорганизмы способствуют обеднению водоемов и почв, так как образующийся свободный азот улетучивается в атмосферу.